La prueba de ADN del cromosoma Y es usada para determinar si dos o más personas de sexo masculino están relacionadas a través de sus padres (a través de la línea paterna/masculina). Esta prueba es a menudo usada para proporcionar evidencia adicional en casos difíciles de paternidad en los que el presunto padre no está disponible para las pruebas. Los resultados de estas pruebas pueden también ser usadas para confirmar a los parientes biológicos de un adoptado.

El cromosoma Y es transmitido de padre a hijo relativamente sin cambios a través de varias generaciones. La prueba de ADN del cromosoma Y examina localidades específicas en el cromosoma Y para generar un perfil Y-STR para cada persona del sexo masculino sometida a prueba. Los hombres que estén relacionados a través de sus padres tenderán a tener los mismos o similares perfiles de Y-STR, y los hombres que no estén relacionados tendrán probablemente diferentes perfiles de Y-STR.

A pesar de que un análisis de Y-STR no puede distinguir entre hombres que pertenecen a la misma línea paterna, es útil para excluirlos a estos hombres de una presunta relación biológica. Por ejemplo, si un hijo y su presunto tío (hermano de padre y madre del presunto padre) son sometidos a prueba, sus perfiles de Y-STR deben coincidir. Si no coinciden, entonces el presunto tío es excluido (no considerado un tío biológico) y el presunto padre probablemente no será el padre biológico.